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產品描述：

Fluo-8，是目前最亮的可見光激發波長Ca2+熒光探針,其熒光強度比Fluo-4強兩倍，比Fluo-3強四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+親和力，幾乎接近Fluo-3，Fluo-4 (Fluo-3: Kd=0.4μM. Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM)，使用上幾乎同Fluo-3和Fluo-4。

Fluo-8不僅維持Fluo-3，Fluo-4便捷的光譜檢測特性，與Ca2+結合后的最大激發波長為490nm, 最大發射波長為514nm。而且具有改善的細胞載入和Ca2+響應能力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37°C孵育皆染色良好，不像Fluo-3, Fluo-4嚴格要求在37℃孵育， 此特征使其更適用于HTS高通量篩選實驗。Fluo-8應用廣泛，與許多細胞系和靶向樣本兼容，不會受配體或靶標本身信號干擾。Fluo-8可通過激光共聚焦顯微鏡流式細胞儀、熒光酶標儀。熒光顯微鏡等來檢測胞內鈣離子水平的變化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一種乙酰甲酯衍生物，具有細胞膜滲透性，只需簡單培養，即可輕易進入細胞。一旦進入細胞內，即被其內酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-8,從而滯留在細胞內以發揮相應生理功能。本品以50μg小包裝的凍干粉形式供貨，用于細胞內Ca2+水平檢測時，常用濃度為1-5μM。

操作說明：

一.使用鈣指示劑AM Esters加載細胞：

     AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內的細胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應在使用前用高質量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應在-20°C下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應穩定數月。

     以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。該方案僅提供指南，實際情況應根據您的具體需求進行修改。

a）在高質量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實驗當天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或將等份的指示劑儲備溶液解凍至室溫。使用0.02％Pluronic?F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備1至10μM的工作溶液。對于大多數細胞系，我們建議鈣指示劑的最終濃度為4-5 uM。 細胞加載所需指標的確切濃度必須根據經驗確定。 為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產生足夠信號強度的最小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic?F-127有時用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。

c）如果您的細胞含有有機陰離子轉運蛋白，可以在細胞培養基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化指標的泄漏。 在室溫或37°C下用鈣指示劑酯孵育細胞20分鐘至1小時。

d）在HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉運蛋白抑制劑，如2.5mM丙磺舒，如果適用）中洗滌細胞1-2次以除去過量的探針。

e）在所需的Ex / Em波長下進行實驗。

二.測量細胞內鈣響應：

     為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：[Ca]free = Kd[F - Fmin]/Fmax - F]

     其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，Fmin是不存在鈣時的熒光，Fmax是鈣飽和探針的熒光。 解離常數（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準溶液相比，熒光指示劑的Ca2 +結合和光譜性質在細胞環境中變化非常顯著。 細胞內指標的原位校準通常產生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細胞暴露于受控的Ca 2+緩沖液來進行原位校準。 或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細胞外培養基的受控Ca2 +水平。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并帶一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。