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作用機制:

X-Gluc，也稱為5- Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)， 是β-葡萄糖苷酶 (β-glucuronidase, GUS)的顯色底物，由一種廣泛使用的報告基因gusA (uidA) 所編碼。GUS水解X-Gluc, 生成一種無色的葡萄糖醛酸和一種肉眼可見的氯-溴靛藍(chloro-bromoindigo) 深藍色沉淀。利用這一特性, X-Gluc常 用來檢測植物細胞和組織中的GUS表達;另外, X-Gluc還能用來檢測大腸桿菌引起的感染狀況;或檢測食物或水源是否受細菌污染。

主要應用：轉基因植物報告基因GUS活性檢測，X-gluc用作顯色底物。

普遍應用優勢在于：絕大多數植物細胞內不存在內源性的GUS活性,而且GUS基因表達產物具有檢測方法簡單、靈敏度高，易于定量及定性分析，能夠與其他蛋白質基因融合等優勢，因此，GUS基因為植物工程研究中應用最廣泛的報告基因(報道基因)之一。

1. GUS活性檢測(組織化學定位法,定性研究)

GUS催化底物X-gluc在酶活性位點生成深藍色沉淀，為研究外源基因在植物中表達具體部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和顯色產物非常穩定，植物中可以積累。

1.1 GUS染色液制備[作為參考，可按照具體實驗條件來調整]

1.2 GUS定性染色步驟

a)于預冷固定液(4%多聚甲醛溶液，新鮮制備)固定樣本30min,偶爾搖晃或置于低速搖床上固定;

b)使用預冷的1 x磷酸鹽或檸檬酸鹽酸溶液清洗固定樣本30-60min,中間更換幾次清洗液;

c)真空滲透法將X-Gluc染色液加入待染色樣本 [對于組織培養的擬南芥不需用真空滲透; ]黑暗條件室溫或者37°C孵育幾小時或過夜,或者明顯的藍色沉淀出現(不超過24h) ;

d)去離子清洗染色樣本;

e)對于綠色樣本， 使用70%乙醇脫色直到葉綠體完全去除，然后轉移到去離子水內清洗;對于種子或其他樣本，參考文獻An ImprovedClearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法;

f) 肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍色小點即為GUS表達位點。

[備注] :可直接訂購我司(MKbio) 提供的GUS染色試劑盒(組織化學法) , 經濟實惠，使用方便,節省溶液配制的大量麻煩步驟。

2. GUS活性檢測(熒光分析法,定量研究)

GUS催化熒光底物MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸,將其水解為4-MU (4-甲基傘型酮)和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羥基解離后在365nm的光激發下產生455nm的熒光。此時用熒光分光光度計測定得到的是相對值,因此同時需要用標準物4-MU進行校準。

熒光定量分析GUS活性有兩種基本方法: 1) 在一個時間點測定GUS酶作用產物的總熒光量， 需要設定空白對照，以消除內源熒光強度; 2)測定一段時間內GUS的動力學過程。在酶反應初始階段，酶作用產物與時間呈線性關系，而內源性熒光物質的熒光量與時間無線性關系。由此可計算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白質。有時也可以用樣本的鮮重來表示。

2.1檢測步驟[僅作參考，根據具體實驗條件做適當調整]

a)取約100mg愈傷組織或一片新鮮葉盤于1.5m|離心管內,加入100u|萃取緩沖液(extraction buffer)內勻漿。可加入少量沙子或玻璃珠提高研磨效率。

萃取緩沖液(extraction buffer) 配方: 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，10mM DTT, 1mM Na2EDTA, 0.1%十二烷基肌氨酸，0.1%Triton X-100

b) 4°C, 15.000rpm離心5min.收集上清轉移到另一干凈的1.5ml離心管， 冰上放置待用。

c)取50μl 上述萃取上清到0.5ml 37°C預熱的反應緩沖液(Assay buffer) ;用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應緩沖液(Assay Buffer) :稱取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液,此時即為1mM MUG反應液。4°C保存，2周穩定。

d)在某一時間段內(高GUS活性樣本30min;或低GUS活性1h-過夜; )吸取100μl溶液到含900μl終止液(Stop Buffer)的1.5ml離心管內，做好標記。有可能采集3-4個時間點和過夜孵育的時間點熒光量。[用熒光分光光度計在激發波長365nm、 發射波長455nm下，狹縫10nm時測定不同時間點的熒光強度值。]

e)以熒光強度值對反應時間作曲線，求出單位時間的熒光強度變化。用單位時間的熒光強度變化除以參加反應的蛋白量,求出單位質量的蛋白單位時間的熒光強度變化。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。